生物分子類(lèi)實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理匯總
[2015/4/27]
一、GST pull-down實(shí)驗(yàn)：
將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過(guò)柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡(jiǎn)單易行，操作方便。注：GST即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)
二、足印法（Footprinting）：
用來(lái)測(cè)定DNA-蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的方法，用于檢測(cè)目的DNA序列與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可展示蛋白質(zhì)因子同特定片段之間的結(jié)合。其原理為：DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，DNA與蛋白的結(jié)合區(qū)域不能被DNase（脫氧核糖核酸酶）分解，在對(duì)目的DNA序列進(jìn)行檢測(cè)時(shí)便出現(xiàn)了一段無(wú)DNA序列的空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸數(shù)目及其核苷酸序列。
三、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）：
研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達(dá)的關(guān)系。
其原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別 反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的片段沉淀下來(lái)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。
四、基因芯片（又稱生物芯片）技術(shù)：
指將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說(shuō)，就是通過(guò)微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)、乃至百萬(wàn)計(jì)的特定序列的片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2cm²的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片�；蛐酒饕糜诨驒z測(cè)工作。
原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。
五、高效液相色譜（HPLC）：
在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。
高壓泵將貯液罐的流動(dòng)相經(jīng)進(jìn)樣器送入色譜柱中，然后從檢測(cè)器的出口流出，這時(shí)整個(gè)系統(tǒng)就被流動(dòng)相充滿。當(dāng)欲分離樣品從進(jìn)樣器進(jìn)入時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器的流動(dòng)相將其帶入色譜柱中進(jìn)行分離，分離后不同組分依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將進(jìn)入檢測(cè)器的信號(hào)記錄下來(lái)，得到液相色譜圖。
六、噬菌體展示技術(shù)：
將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。
噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫(kù)與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過(guò)一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過(guò)3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來(lái)做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。
七、RNA提�。�Trizol法）：
Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。
八、RT-PCR：
將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。
九、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR）：
利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。
閾值：是循環(huán)開(kāi)始3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期。
C(t)值：熒光信號(hào)（擴(kuò)增產(chǎn)物）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。
十、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（E。coli DH5α）制備：
1、前夜接種受體菌（DH5?或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)到第二日（約16小時(shí)）；
2、取1ml已培養(yǎng)到第二日的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2。5-3小時(shí)（250-300rpm）；
3、將0。1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作；
4、吸取1。5ml培養(yǎng)好的菌液至1。5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；
5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
6、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0。1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；
7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
8 、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0。1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮；
9 、細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?/FONT>70℃）。
十一、堿變性提取質(zhì)粒DNA：
基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12。6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4。8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。
十二、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選：
（1）分---PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫(kù)篩選
（2）切---限制性內(nèi)切酶切割：粘性末端、平末端
（3）接---目的基因與載體相連：利用DNA聚合酶反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個(gè)或者幾個(gè)A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補(bǔ)配對(duì)，經(jīng)連接酶作用，完成與載體的連接。
（4）轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞
感受態(tài)細(xì)胞：經(jīng)過(guò)電擊、CaCl2、RuCl等化學(xué)試劑處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過(guò)時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)。
（5）篩---篩選陽(yáng)性重組體
十三、RNA干擾（RNAi）：
一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過(guò)促使特定基因的mRNA降解來(lái)高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。
十四、cDNA 末端快速擴(kuò)增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)：
基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來(lái)的、以部分的已知區(qū)域序列為起點(diǎn)，擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域，從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。即從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長(zhǎng)cDNA5’和cDNA3’末端，進(jìn)而獲得獲得全長(zhǎng)cDNA簡(jiǎn)單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此近年來(lái)RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)，成為克隆全長(zhǎng)cDNA序列的常用手段。
十五、mRNA差異顯示技術(shù)（DD-PCR）：
將mRN A逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。每一種細(xì)胞（包括同一組織細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的處理）都有其特異表達(dá)的不同于其他組織細(xì)胞的基因譜（有差異基因表達(dá)），即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達(dá)是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，正是這些基因在細(xì)胞中的特異表達(dá)與否，決定了生命歷程中細(xì)胞的發(fā)育和分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老和凋亡等。mRNA DDR T－PCR 技術(shù)正是對(duì)組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速而行之有效的方法。 其基本原理是從基因背景相同的2個(gè)或幾個(gè)被比較的細(xì)胞系或組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，用不同引物對(duì)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)加入同位素標(biāo)記的核苷酸。利用測(cè)序膠電泳技術(shù)分離PCR 產(chǎn)物，經(jīng)放射自顯影即可找到差異表達(dá)的基因。
十六、抑制差減雜交：
原理抑制差減雜交技術(shù)(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差減雜交方法相結(jié)合的方法。其依據(jù)兩點(diǎn):(1)消減雜交;(2)抑制PCR。經(jīng)抑制差減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達(dá)基因(目的基因)，而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過(guò)均等化作用已基本消除，使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。
抽提兩種不同來(lái)源組織的mRNA(tester和driver)，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用4堿基識(shí)別酶(RsaI)或HaeIII酶切兩種cDNA產(chǎn)生平端片段;將testerc DNA分成均等的兩份，分別接上dapter1和adapter2兩種接頭，并與過(guò)量的經(jīng)RsaI消化的driver樣本變性后退火雜交。第一次雜交后有4種產(chǎn)物:a是單鏈testercDNA;b是自身退火的testercDNA雙鏈;c是tester和driver的異源雙鏈;d是drivercDNA。
根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的單鏈cDNA退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA，因此第一次雜交使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對(duì)含量趨向一致。混合兩份雜交樣品，同時(shí)加入新的變性driver cDNA 進(jìn)行第二次消減雜交。雜交完全后補(bǔ)平末端，加入合適引物(即adapter1和adapter2的部分特異序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有含不同接頭的雙鏈DNA分子(e)才可進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的片段。利用adapter上的酶切位點(diǎn)可進(jìn)行克隆、測(cè)序等。
十七、雙向凝膠電泳（2-DE）：
原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。
十八、mRNA的分離與純化（寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA）：
真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個(gè)腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
十九、His-tag純化蛋白：
His-Tag序列（6、8或10個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基）與固定在基于NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的His-Bind樹(shù)脂上的二價(jià)陽(yáng)離子Ni2+結(jié)合。洗去未結(jié)合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標(biāo)蛋白。該通用系統(tǒng)使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。
二十、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)方法 (RNase Protection Assay，RPA)：
是近十年發(fā)展起來(lái)的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。
與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1。 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2。 由于PCR擴(kuò)增過(guò)程中效率不均一和反應(yīng)“平臺(tái)”問(wèn)題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒(méi)有擴(kuò)增過(guò)程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。3。由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。4。步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過(guò)程。5。 RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無(wú)探針自身復(fù)性問(wèn)題，無(wú)須封閉。6。 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性問(wèn)題。7。 檢測(cè)分子長(zhǎng)度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。
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